BIOTRIN je nezisková organizace vytvořená vědeckými
pracovníky pro šíření informací o moderních biotechnologiích.
Je tu pro vaši informaci a jako fórum vašich názorů.

Detekce změn DNA pomocí CRISPR čipů

V posledních letech našli výzkumníci řadu využití pro CRISPR technologii. Mimo vytváření cílených změn v DNA či RNA bylo popsáno i použití CRISPR komplexů pro detekci editace pomocí tzv. CRISPR čipů.

Kiana Aran s kolegy z USA a Španělska imobilizovali protein dCas9, který nemá nukleasovou aktivitu, na vrstvu grafenu v tranzistoru gFET. Po přidání sgRNA se vytvořil CRISPR komplex, který výzkumníci použili k prokázání delecí v DNA. Pokud byla v analyzovaném vzorku přítomna cílová DNA sekvence komplementární k jednovláknové sgRNA čipu, navázala se a vazba změnila vodivost grafenového materiálu v tranzistoru. Změna byla detekována pomocí ruční čtečky za méně než 15 minut - viz obrázek.

Před analýzou prostřednictvím CRISPR-čipu nebylo nutné provádět amplifikaci DNA, čip využívá komplementarity sgRNA v CRISPR komplexu se sekvencí v analyzovaném vzorku spolu s vysokou citlivostí grafenu.

Specifita imobilizovaného CRISPR komplexu k jeho cílové sekvenci byla nejprve testována s amplifikačními PCR produkty bfp genu, který kóduje modrý fluorescenční protein a je často používán pro validaci editace genu prostřednictvím CRISPR-Cas. Odpověď senzoru na přítomnost cílové molekuly byla monitorována v reálném čase a data byla analyzována po inkubaci a promytí.

Poté výzkumníci prokázali účinnost čipu testováním digitální detekce mutací DNA v Duchennově svalové dystrofii (DMD), genetické poruše, která má za následek progresivní svalovou degeneraci a zkrácení očekávané délky života.

Vývoj takovéto platformy vyžaduje velmi dobré pochopení nanotechnologií a elektroniky, multi-univerzitní výzkumný tým musel nejen optimalizovat CRISPR komplexy, ale také elektroniku. Testování genetických mutací je jen jedním z možných polí aplikací tohoto čipu.

V současné době Aran s kolegy hodnotí použití CRISPR čipu pro detekci jednobodových mutací a ve svém dalším výzkumu by se rádi zaměřili na detekci infekcí.

Čipy však mají potenciální aplikace i mimo lékařskou diagnostiku a to například pro účely kontroly kvality ve farmaceutických společnostech, čip by jim umožnil lépe vyhodnotit účinnost technologie CRISPR.

Mimo to se nabízí použití čipu pro prokázání editace při řešení výzkumných úkolů, například pro rychlý screening transformovaných rostlin. Specifita čipu je dána použitou sgRNA, navázání různých sgRNA by tedy mělo umožnit multiplexní analýzy, tzn. stovky nebo tisíce testů najednou.

Rychlost analýzy, použití neamplifikované genomové DNA, absence použití složitého přístrojového vybavení, snadná interpretace dat a možnost standardizace čipů by mohla vést k širokému použití i při prokazování editace v potravinách a potravinářských surovinách.

 

Zdroj: Hajian, R., Balderston, S., Tran, T., deBoer, T., Etienne, J., Sandhu, M., . . . Aran, K. (2019). Detection of unamplified target genes via CRISPR–Cas9 immobilized on a graphene field-effect transistor. Nature Biomedical Engineering. doi:10.1038/s41551-019-0371-x

Legenda k obrázku: dCas9 v komplexu s cílově specifickou sgRNA je imobilizován na povrchu grafenu uvnitř gFET. Imobilizovaný komplex skenuje genomovou DNA vzorku, dokud v ní neidentifikuje svou cílovou sekvenci komplementární k 5 ‘konci sgRNA, rozbalí dvojitou šroubovici a váže se k ní. Tato selektivní vazba cílové DNA mění elektrické charakteristiky gFET, které jsou měřeny.