Cas-CLOVER - alternativa ke CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 je nejpoužívanějším systémem pro editaci genů, kterým se provádí genetické úpravy požadovaných vlastností u rostlin, zvířat a jiných organismů. Je to velice přesná editační metoda využívající tzv. naváděcí molekulu gRNA (guide RNA) a Cas9 (endo)nukleasu (enzym štěpící nukleovou kyselinu rozkladem fosfodiesterové vazby) k vytvoření zlomu v dsDNA na místě sekvence komplementární ke gRNA (Obr. 1).

Obrázek 1

snadné použití
jedna naváděcí gRNA
určité množství nespecifických zásahů („off-target“ aktivita).

V některých případech však nedochází ke štěpení pouze v místě přesně komplementární sekvence ke gRNA, ale i k tzv. necílovým zásahům, tedy štěpení v necílových místech genomu editovaného organismu. Těmto necílovým zásahům editačního nástroje CRISPR se výzkumníci samozřejmě snaží zabránit. Testovány jsou různé modifikace jako např. použití zkrácené gRNA, přídavek GG na 5´konec či indukované exprese (např. teplem).

Od začátků používání již CRISPR/Cas9 prokázal vysokou účinnost u genových editací v nekomerčním prostředí. Stále však existují nezodpovězené otázky týkající se volného použití systému v komerční oblasti, a mnoho potenciálních uživatelů tak zůstává mimo hru.

Na webináři pořádaném 14. dubna 2020 Genetic Engineering and Biotechnology News (GEN) byla představena nová technologie pro úpravu genů s názvem Cas-CLOVER. Cas-CLOVER^TM, vyvinutý společností Hera BioLabs (USA), je funkčně podobný CRISPR/Cas9, ale používá jiný nukleasový protein, nazývaný Clo51. Cas-CLOVER je fúzní protein, patentově chráněný, který obsahuje nukleasou inaktivovaný protein Cas9 fúzovaný s Clo51 endonukleasou (Obr. 2).

Obrázek 2

dCas9 je mutován a není schopen štěpit DNA; slouží pouze jako protein vázající se na DNA. Štěpná aktivita závisí na dimerizaci nukleasy Clo51
snadné použití
dvě naváděcí gRNA
vysoce efektivní rozpoznávání RNA je řízené defektní dCas9; vysoká přesnost.

Systém CRISPR/Cas9 používá jedinou naváděcí gRNA a (jak je uvedeno výše) bylo prokázáno, že vytváří nežádoucí mutace. Cas-CLOVER dosahuje větší specifičnosti díky využití dvou navádějících RNA a také tím, že pro nukleasovou aktivitu je nutná dimerizace podjednotek spojených s každou naváděcí gRNA.

Specifita systému byla nedávno prokázána v epiteliální buněčné linii odvozené z vaječníku křečka čínského (CHO buňky). Potvrdilo se, že systém Cas-CLOVER je stejně snadno použitelný jako CRISPR/Cas9 a při zachování vysoké účinnosti úprav nebyla detekovatelná necílová „off-target“ aktivita.

Cas-CLOVER je tedy alternativní vysoce přesná technologie úpravy genů společnosti Hera, která je jasně zaštítěna vydanými patenty a vykazuje nezjistitelnou necílovou “off-targed“ aktivitu. Je výlučně licencovaná společností Hera, sublicencovaná toutéž společností. Hera BioLabs nabízí komerční a výzkumné licence, a také službu ověření konceptu pro tuto technologii např. při výzkumu a v raných fázích vývoje léků.

Zdroje (včetně obrázků):