Sójové boby se zvýšeným obsahem oleje a bílkovin

  • organismus: sója
  • nová vlastnost: zvýšený obsah bílkovin a pozměněný obsah mastných kyselin v triacylglycerolech (TAG)
  • zacíleno na: spotřebitele
  • technika vzniku: CRISPR/Cas9
  • povoleno v EU: ne

(c) Ing. Barbora Hošková, VŠCHT Praha

Semena sóji obsahují vysoké procento kvalitních bílkovin (okolo 36 %) i nenasycených mastných kyselin, obsah sacharidů v semenech sóji bývá přibližně 30 %, toto složení je předurčuje pro využití i jako možnou náhradu masa. I přes tyto vhodné výživové vlastnosti probíhají další výzkumy, které cílí na změnu složení sójového oleje a zvýšení obsahu bílkovin. V roce 2016 byly popsány mutace enzymu diacylglycerolacyltransferasy (DGAT), jejichž exprese v somatických embryích sójových bobů vedla ke zvýšení obsahu oleje až na 10 % ve srovnání s 5 % oleje dosaženými nadměrnou expresí odpovídajících DGAT standardního typu. Varianta DGAT sójových bobů, která poskytla největší nárůst množství oleje v semenech, obsahovala 14 aminokyselinových substitucí z celkového počtu 504 aminokyselin (97% sekvenční identita s nativní sekvencí). DGAT transgeny rovněž významně snížily ve zralých semenech obsah rozpustných sacharidů a zvýšily obsah proteinů.

Sója GE-DGAT1B byla vytvořena pomocí CRISPR/Cas editace genu kódujícího enzym diacylglycerolacyltransferasu typu 1 (dgat1), katalyzující poslední krok při produkci oleje. Enzym DGAT1 se nachází v mnoha rostlinných druzích, včetně sóji. Pro změnu složení sójového oleje byly již v dřívějších výzkumech navrženy různé strategie, z nichž některé byly založeny právě na zlepšení kinetických vlastností enzymu DGAT1. Analýzou existujících variací primární sekvence proteinu DGAT1 napříč různými rostlinnými druhy bylo zjištěno, že přítomnost určitých aminokyselinových zbytků na pozici 479 sójového proteinu DGAT1B přispívá ke zvýšení obsahu oleje a proteinů. Takovouto aminokyselinou je například serin (S), jeho přítomnost v pozici 479 enzymu DGAT18 změnila složení olejů při pokusech prováděných pomocí transientní exprese v kvasinkách a tabáku. Sójový protein DGAT1B má v poloze 479 aminokyselinu izoleucin (I), proto byla výzkumníky z Corteva AgriscienceTM studována právě substituce aminokyselin I479S v sójovém proteinu DGAT1B.

Editace genu v linii sóji GE-DGAT18 tedy vedla k substituci bází genu dgat1b  a byla provedena plasmidem vloženým do buněk sóji prostřednictvím bakterie Ochrobactrum haywardense kmen H1-8 (Oh H1-8). Editace byla uskutečněna pomocí techniky označované jako SDN2 (angl. Site-directed nuclease-2). Tato technika zahrnuje rozštěpení obou vláken cílové dsDNA a změnu krátkého úseku sekvence DNA pomocí homologní rekombinace. Substituce I479S spočívala ve změně tří párů bází, byl tedy změněn triplet kódující isoleucin (ATA) na triplet kódující serin (TCT). Navíc byla do sekvence sójové DNA zavedena ještě jedna substituce páru bází (T až C) za místem změny aminokyseliny. Toto je postup používaný k ochraně substituované DNA před štěpením nukleasou Cas9, protože její sekvence by jinak byla identická s cílovou sekvencí naváděcí sgRNA2 použité k editaci. Tato další substituce báze byla záměrně navržena tak, aby vedla k tzv. tiché mutaci, tj. mutaci nezpůsobující substituci aminokyseliny.

Zamýšlené substituce bází byly potvrzeny analýzou sekvenováním nové generace (NGS). Bylo prokázáno, že sójové boby GE-DGAT1B obsahují substituci jedné aminokyseliny v pozici 479 (I479S). K vyloučení přítomnosti neúmyslně integrované DNA z transformačního plazmidu byla použita metoda nazvaná Southern-by-sekvenování, spojující hybridizaci se sondou a NGS sekvenování. Tato technologie byla popsána v roce 2015 a využívá zachycení sekvencí (angl. sequence capture) před vlastním sekvenováním, čímž umožňuje cílenou sekvenaci specifických oblastí genomu a poskytuje účinnou strategii pro vysoce výkonný screening vybraných sekvencí genomu usnadňující identifikaci a charakterizaci fyziologicky relevantních variant.

Pomocí sekvenačních technik bylo prokázáno, že sójové boby GE-DGAT1B neobsahují žádný vložený genetický materiál z organismu dárce, příjemce nebo vektoru, pouze modifikaci 4 bází. Výše uvedené substituce aminokyselin v genu dgat1 by navíc mohlo být dosaženo pomocí konvenčních šlechtitelských technik. Je známo, že variabilita aminokyselinových zbytků v pozici 479 proteinu DGAT1B a zejména výskyt serinu existuje u několika rostlinných druhů. Jednonukleotidový polymorfismus (SNP, angl. Single Nucleotide Polymorphism) je v rostlinách nejrozšířenějším typem mutací a tedy nejčastějším zdrojem genetických variací druhu. Alelické rozdíly mezi různými odrůdami stejného druhu často nejsou omezeny jediným SNP nebo jedinou substitucí aminokyseliny, genomy rostlin jsou ze své podstaty variabilní a konvenční šlechtění při vývoji nových odrůd využívá spontánní i indukovanou variabilitu genomu. Finální linie sóji GE-DGAT1B neobsahuje neúmyslně integrovanou DNA z transformačního plazmidu, je tedy nerozeznatelná od rostlin sóji, která by mohla vzniknout variabilitou přirozeného genomu nebo být vyvinuta v konvenčním šlechtitelském programu.

Aktualizace ke dni: 12.7.2023

Zdroje:

https://www.aphis.usda.gov/biotechnology/downloads/reg_loi/20-168-14_air_inquiry_nocbi.pdf

https://www.euginius.eu/euginius/pages/gmo_detail.jsf?gmoname=GE-DGAT1B+Soybean

Zastrow‐Hayes, G. M.; Lin, H.; Sigmund, A. L.; Hoffman, J. L. Alacron, C. M.; Hayes, K. R.; et al. Southern‐by‐sequencing: A robust screening approach for molecular characterization of genetically modified crops.The Plant Genome 2015, 8, plantgenome2014-08. https://doi.org/10.3835/plantgenome2014.08.0037

Roesler, K.; Shen, B.; Bermudez, E.; Li, C.; Hunt, J.; Damude, H.; et al. An improved variant of soybean type 1 diacylglycerol acyltransferase increases the oil content and decreases the soluble carbohydate content of soybeans. Plant Physiol. 2016, 171, 878−893. https://doi.org/10.1104/pp.16.00315